Neuron︱王立平团队揭示睡眠与恐惧调控的“共享”神经环路

撰文︱研究员 滔滔

来源︱滔博生物

责编︱王思珍

睡眠的特征是行为静止，对外界刺激的唤醒阈值增加，导致更容易受到捕猎等威胁。尽管有捕猎压力，睡眠在进化过程中的持续存在表明了它对生存的重要性。在许多爬行动物、鸟类和哺乳动物中，睡眠由两种交替的状态组成，并具有不同的特征：快速眼动（REM）和非快速眼动（NREM）阶段。在暴露于压力源的啮齿动物和有压力相关精神障碍的人类中观察到睡眠模式产生的变化，会增加REM睡眠。这暗示了REM睡眠在应对应激反应中的功能作用。

动物经常面临来自捕猎者、非生物因素或攻击性同类的威胁。因此，大脑进化出了使用感官输入来检测威胁的防御系统。捕猎者的嗅觉或视觉线索通常会触发威胁反应，包括增强唤起和防御行为。捕猎者的气味，如三甲基噻唑啉（TMT），会导致瞳孔增大和防御行为（如逃跑或冻结行为）。来自上视野的潜在刺激模仿接近的空中捕猎者（looming）也会导致小鼠的防御行为。考虑到动物在从REM睡眠期醒来后比NREM睡眠期更警觉，REM睡眠期可能通过允许更高的防备危险的准备状态来保护睡眠中的动物。除了提高警觉性外，迅速从睡眠中醒来的能力是成功抵御急性威胁的重要先决条件。然而，目前还不清楚，睡眠中的动物是否能对捕猎线索做出反应，以及在REM睡眠和清醒期间是否存在特定的神经环路会引起快速觉醒和行为防御。

基底神经节（BG）是构成一个情绪、认知和运动控制中心，并参与睡眠-觉醒调节。丘脑下核（STN）是调节BG输出的关键结构。对人的STN进行脑深部电刺激，会改变睡眠结构，造成精神不良以及类似压力的症状，尤其是当刺激接触靠近内侧部分时，表明STN在压力和睡眠-觉醒控制的整合中发挥作用。

2022年1月22日，中国科学院深圳先进技术研究院、深港脑科学创新研究院的王立平团队在Neuron在线发表了题为“The subthalamic corticotropin-releasing hormone neurons mediate adaptive REM sleep responses to threat”的研究论文。利用Inscopix自由活动钙成像显微镜和细胞类型特异性操作，首次揭示了调控快速眼动睡眠与本能防御行为的“共享”神经环路，此大脑的“节能”模式的建立可能在进化过程中因适应环境的挑战而得到了发展和强化，此“共享”环路的发现揭示了快速眼动睡眠具有潜在“防御天敌”的功能。适应性快速眼动睡眠反应可以保护我们免受威胁，并在其基础上揭示神经环路的一个关键组成部分。

捕猎性刺激促进REM睡眠的快速觉醒

自然睡眠通常包括闭眼，阻止外部信号的视觉感知。作者使动物适应在封闭行为箱内睡觉，并在光照阶段释放捕猎者刺激，即TMT气味。TMT通过REM睡眠而不是NREM睡眠诱导快速觉醒。TMT诱导的防御行为不仅受到嗅觉通路的调控，而且还受到表达瞬间受体电位离子通道蛋白1（TRPA1）基因的三叉神经细胞的调控。

为了进一步验证TMT从REM睡眠中唤醒的动物是否更警觉，作者记录了瞳孔的大小，因为瞳孔的增大可以反映身体准备好对威胁做出适应性反应的警觉水平。头部固定的小鼠睡觉时的脑电图/肌电图信号与自然睡眠时相似，而且也是睁开眼睑睡觉。当小鼠在REM睡眠中暴露于TMT时，瞳孔大小和运动速度迅速增加。REM睡眠具有特定的特性，能够对非视觉的捕猎性刺激做出快速唤醒反应，并成功地防御危及生命的事件。

在REM睡眠和觉醒期间，mSTN-CRH神经元对捕猎性刺激的反应

将携带CRH启动子驱动的Cre和Cre诱导的GCaMP6m的腺相关病毒（AV）注射到野生型（WT）小鼠的mSTN中（图1 A-B）。大约80%的细胞共表达GCaMP6m和内源性CRH，表明CRH启动子驱动的病毒结构的特异性和有效性（图1 C-D）。与NREM睡眠相比，在清醒和REM睡眠期间的活动更大，并且在REM睡眠期间的活动水平最高（图1 E）。研究发现mSTN-CRH的活动在整个REM-sleep期间都是动态的，在REM开始后逐渐增加，在觉醒开始后很快减少（图1 F）。在REM睡眠期间，TMT暴露诱发mSTN-CRH神经元的时间锁定活动，而在NREM睡眠时给予TMT则未观察到神经活动的显著变化（图1 G）。有趣的是，TMT在清醒小鼠中引起了mSTN-CRH神经元的强烈反应（图1 H）。因为清醒的动物会根据视觉信息评估捕猎风险并精心设计逃脱行为。当小鼠受到Looming刺激时，mSTN-CRH神经元是否也受影响。事实上，作者观察到mSTN-CRH神经元中GCaMP6m信号增加（图1 I-J）。此外，暴露于虚拟捕猎性大鼠诱发了mSTN-CRH神经元的强烈反应。当小鼠接近大鼠区域时，神经活动增加，而在逃跑时下降（图1K-L）。因此，在清醒状态下，威胁通过视觉和嗅觉通道激活了mSTN-CRH神经元。

图1 警觉状态下mSTN-CRH神经元对布列星刺激反应的神经元活动

（图源：Tseng et al., Neuron, 2022）

抑制mSTN-CRH神经元可减弱对捕猎性刺激的防御行为

通过抑制DREADD的双侧表达来评估这些神经元的化学基因失活的行为效应（图2 A-B）。急性脑切片的全细胞记录证实，这种操作能有效抑制mSTN-CRH神经元（图2 A）。在REM睡眠时，hM4Di小鼠注射CNO（氯氮平N-氧化物）延长了TMT暴露后的觉醒潜伏期，但不影响NREM睡眠期间的觉醒潜伏期（图2 C）。睡眠脑电确定了TMT时的NREM或REM睡眠状态：NREM睡眠以δ波为主；REM睡眠以θ波为主（图2 D）。与无抑制的小鼠相比，在REM睡眠期间，对mSTN-CRH神经元的化学遗传持续降低了TMT刺激觉醒后瞳孔大小的增加（图2 E）。在此操作后，TMT诱发的瞳孔变化在从REM睡眠过渡到清醒状态时下降到与NREM睡眠过渡到清醒状态时相似的水平（图2 E）。这些结果表明：mSTN-CRH的活动对于TMT刺激的REM睡眠期觉醒和REM觉醒后对TMT的觉醒反应增加是必需的。

在光照阶段，捕猎性刺激出现前1小时给小鼠注射CNO。HM4Di小鼠不仅表现出较长的冻结潜伏期，而且总冻结时间也较少（图2 F）。hM4Di小鼠也表现为逃避潜伏期更长，返回避难所的时间更长，在避难所中躲藏的时间更短（图2 G）。离体电生理实验发现黄色光遗传刺激导致表达eArch3.0的神经元的放电频率和超极化降低（图2 H-J）。在睡眠状态下的行为测试中，与EYFP小鼠相比，在REM睡眠期间光遗传刺激eArch3.0小鼠暴露于TMT后，觉醒潜伏期增加（图2 L）。在NREM睡眠中刺激没有影响（图2 L）。脑电功率谱分析证实了TMT呈现时的睡眠状态（图2 M）。与EYFP小鼠相比，光遗传刺激eArch3.0小鼠的首次冻结潜伏期延长，总冻结时间减少（图2 N）。这些结果表明：光遗传和化学遗传抑制具有相似的作用，并且在REM睡眠和清醒状态下，mSTN-CRH神经元的活动是控制觉醒和防御行为所必需的。

图2 mSTN-CRH神经元在快速眼动睡眠和清醒状态下唤醒和防御反应的必要性

（图源：Tseng et al., Neuron, 2022）

在NREM睡眠中，5 Hz或10 Hz的光遗传刺激不会促进状态过渡到REM睡眠，但会以频率依赖的方式促进状态过渡到清醒，而对mCherry小鼠没有影响（图3 A-F）。有趣的是，光遗传刺激在REM睡眠中不能引起清醒（图3 E）。为了进一步了解mSTN-CRH在REM睡眠期间的活动，作者采用了一种闭环方案：光遗传刺激从REM睡眠开始，并保持到过渡到清醒状态。在一半的试验中，光遗传激活后10 s出现TMT（图3 C）。有趣的是，在没有TMT表现的试验中，在REM睡眠开始时，以10Hz的光遗传刺激ChR2小鼠显著延长了它们的持续时间，而光遗传刺激对mCherry小鼠没有影响（图3 G）。与mCherry小鼠相比，光遗传刺激缩短了TMT诱导的ChR2小鼠的觉醒潜伏期（图3 H）。研究结果表明，在REM期，mSTN-CRH 的活动可以促进对嗅觉捕猎性刺激的唤醒，但这种作用可能受到其他机制的限制。

此外，作者还研究了mSTN-CRH神经元在清醒小鼠行为防御中的情况。在出现迫近性威胁刺激前进行光遗传刺激（图3 I），对照组和ChR2小鼠的光遗传持续时间没有显著差异（图3 J）。在ChR2小鼠中刺激这些神经元并不能引起直接的逃跑行为。有趣的是，它使瞳孔大小增加到基线的150%，表明唤醒水平升高。与mCherry小鼠相比，ChR2小鼠的光遗传刺激增强了对Looming反应（图3 K）。在门打开的行为箱中，TMT气味诱导的逃逸潜伏期比水诱导的时间短。有趣的是，在这种情况下，小鼠并没有表现出冻结行为，这表明它们的防御策略会根据逃跑的可能性进行调整。研究结果表明：mSTN-CRH神经元介导觉醒状态，该状态是在清醒时进行威胁检测和风险评估所必需的。

以上所有结果说明了mSTN-CRH神经元在REM睡眠中对捕猎性刺激的反应、在警觉状态下控制觉醒，并在清醒状态下增强对各种形式刺激的防御反应中发挥的关键作用。

图3 mSTN-CRH神经元的光遗传激活促进觉醒和增强防御反应

（图源：Tseng et al., Neuron, 2022）

抑制mSTN-CRH神经元可消除对捕猎者刺激的适应性REM睡眠反应

由于连续施加的温和压力（包括捕猎者威胁）导致REM睡眠显著增加，作者设计了一个范式：小鼠持续面对一只大鼠，以测试单独的自然捕猎者的影响（图4 A）。捕猎者持续暴露导致REM睡眠总时间显著增加（图4 B）。REM睡眠适应包括REM睡眠总时间增加，但单个REM睡眠发作和睡眠结构碎片的持续时间缩短（图4 C-D）。在小鼠和大鼠之间的每次直接接触之前，抑制mSTN-CRH神经元可以消除增加的REM睡眠和睡眠碎片（图4 B, D）。

为了进一步探究经历持续捕猎应激的动物是否会改变防御行为的应对策略，作者将mCherry和hM4Di小鼠置于相同的捕猎者范式下（图4 A）。与对Looming刺激的基线反应相比，在捕猎者应激12天后，mCherry小鼠表现出了增强的逃避行为，即更短的逃跑潜伏期和更短的返回避难所的时间（图4 E）。研究表明，暴露在压力下4天后，小鼠对Looming刺激表现出加速的逃避反应。此外，在hM4Di小鼠中，捕猎者应激诱导的逃逸反应增强被减弱。这些发现表明：适应性REM睡眠反应可能对维持动物抵御急性威胁的能力很重要，而mSTN-CRH神经元与这种行为适应有关。

图4 mSTN-CRH神经元是对捕猎者刺激的自适应快速眼动睡眠反应的关键

（图源：Tseng et al., Neuron, 2022）

mSTN-CRH神经元由功能不同的亚型组成

为了研究mSTN-CRH神经元的功能特异性，作者使用Inscopix自由活动钙成像显微镜在单细胞水平测量mSTN-CRH活性。mSTN-CRH神经元中表达GCaMP6m的小鼠植入梯度折射率（GRIN）透镜和EEG/EMG电极，用于睡眠-觉醒记录和微型荧光显微镜光学成像，同时进行行为视频记录（图5 A-D）。在REM睡眠中，作者观察到空间不同的mSTN-CRH神经元显著的钙瞬变（图5 E）。只有3.8%的细胞在NREM睡眠（NREM-max）或两种睡眠状态（NREM/REM-max）中最活跃，20.5%的细胞在任何警惕性状态中没有选择性，在不同睡眠-觉醒状态下，REM-max组、wake/REM-max组和wake-max组的神经元平均活动有显著差异（图5 E-H）。在REM睡眠、NREM睡眠和清醒状态中，连续三次选择的细胞百分比是相似的。在三次REM睡眠中所选择的细胞中，REM-max和REM/wake-max类别共占95.6%。wake-max和REM/ wake-max类型的细胞占清醒状态下连续三次被选择的细胞的61%。在NREM睡眠中，表现出高保真度活动的细胞种类更加多样化。这些结果进一步证实了mSTN-CRH神经元中REM和wake相关细胞的分类。

作者进一步探究了mSTN-CRH神经元的这些亚类是如何被REM睡眠中的捕猎性刺激所招募的。对小鼠进行了三次TMT和Looming刺激试验发现，在161个细胞中，有三分之一的细胞在TMT反应中出现短暂性钙离子增加（图5 D-J）。作者还研究了mSTN-CRH神经元对TMT诱发的REM睡眠-觉醒过渡的贡献，发现TMT反应细胞在这两种状态下钙活性增加，REM-max和REM/wake-max亚型占绝大多数（图5 K-M）。这些观察结果证实了TMT在REM睡眠和清醒期诱发的反应招募了在REM睡眠期间活跃的mSTN-CRH神经元。另外，作者还发现，在清醒状态下，161个总细胞中有24.2%的细胞对Looming有反应，这些有反应的细胞在Looming刺激期间和之后的5 s时间内，显著地显示出更大的GCaMP6m信号，TMT也招募了33.3%的Looming反应细胞（图5 N-Q）。总之，这些结果表明mSTN-CRH神经元可能由功能相似和不同的亚型组成。

图5 mSTN-CRH亚群对捕猎性刺激的神经活动

（图源：Tseng et al., Neuron, 2022）

mSTN-CRH神经元通过LGP通路控制防御反应

接下来，通过靶向不同的投射神经元，以及组织学分析，发现LGP逆行靶向神经元的分布与SNR或IPAC逆行靶向神经元的分布更明显（图6 A-D）。LGP逆行靶向mSTN-CRH神经元的化学发生激活增强了Looming诱发的逃避反应，而SNR或IPAC靶向神经元的激活没有显著的影响（图6 E-F）。此外，双侧抑制LGP逆行靶向的mSTN-CRH神经元减弱了REM睡眠中TMT诱导的觉醒，减弱了清醒状态下的防御反应。在没有捕猎威胁的正常条件下，抑制CRH神经元的mSTN-LGP投射也会减少REM睡眠的总时间。这种操作缩短了REM睡眠时间；然而，它并不影响REM总发作次数和θ节律。总的来说，操纵LGP逆行靶向mSTN-CRH神经元导致的行为变化，其程度与操纵全部mSTN-CRH神经元所观察到的行为变化的幅度相当。

图6 不同投射靶向mSTN-CRH神经元在逃避反应中的作用

（图源：Tseng et al., Neuron, 2022）

此外，与操纵mSTN躯体观察到的行为变化相比较，单侧光遗传刺激mSTN-CRH-ChR2-mCherry小鼠的LGP，导致从NREM睡眠到觉醒的更快过渡，REM睡眠的时间延长，或与mSTN-CRH-mCherry小鼠相比，在暴露于TMT下，REM睡眠的更快唤醒（图6 A, D-G）。在清醒状态下，与mSTN-CRH-mCherry小鼠相比，mSTN-CRH-ChR2-mCherry小鼠的这种操作增强了对捕猎性刺激（如Looming）的逃跑反应（图6 H-I）。

一些投射到苍白球的STN神经元指向SNR显示轴突侧支。因此，作者利用Synaptophysin-EGFP靶向所有侧支轴突末梢中LGP投射的STN-CRH神经元。除了LGP，在SNR和IPAC中发现了EGFP标记的轴突。为了证实LGP通路控制行为变化，作者采用了一种方法，即mSTN-CRH神经元被光遗传激活，而LGP中的神经元被化学遗传抑制（图6 B）。光照阶段注射CNO，1小时后在不同的行为模式下对mSTN进行光遗传刺激。与mSTN-CRH-ChR2-EGFP+LGP-hM4Di-mCherry小鼠相比，在没有TMT的情况下，在mSTN-CRH-ChR2-EGFP+LGP-mCherry小鼠中注射CNO导致从NREM睡眠中醒来的光遗传诱发潜伏期增加（图7 E）。在正常条件下，CNO注射mSTN-CRH-ChR2-EGFP+LGP-hM4Di-mCherry小鼠也减弱了光遗传诱发的REM睡眠延长，并且光遗传促进了TMT暴露后的觉醒（图7 D, F-G）。在觉醒状态下，在mSTN-CRH-ChR2-EGFP+-LGP-mCherry小鼠中注射CNO也削弱了光遗传增强的对Looming的逃逸反应（图7 H-I）。总的来说，与mSTN-CRH-mCherry小鼠相比，同时具有LGP神经元的化学遗传抑制和mSTN-CRH神经元的光遗传激活的小鼠在REM睡眠和清醒期间对捕猎性线索表现出类似的反应。因此，LGP通路在REM睡眠和清醒状态下对防御反应的控制是有效的。

图7 mSTN-CRH神经元通过LGP通路控制快速觉醒和逃逸反应

（图源：Tseng et al., Neuron, 2022）

利用脑切片的全细胞电生理记录，光刺激终止于LGP的mSTN-CRH神经元轴突后，在LGP神经元中检测到光诱发兴奋性和抑制性突触后电流（分别为EPSC和IPSC）（图7J-K）。这些调控可以追溯到这些突触的单突触和异突触排列。作者分别在囊泡谷氨酸转运体（2VGLUT2）-ires-Cre和谷氨酸脱羧酶2（GAD2）-ires-Cre小鼠中注射AAV-DIO-EF1a-EYFP检测mSTN神经元的细胞类型。在VGLUT2-Cre小鼠的mSTN中观察到大量EYFP标记的胞体，这与STN神经元主要具有谷氨酸作用一致。有趣的是，在VGLUT2-Cre小鼠中可以观察到LGP中的强投影，而在GAD2-Cre小鼠中则没有。此外，mSTN中的CRH神经元主要表达VGLUT2。这些细胞结构特征以及LGP神经元中IPSCs的平均突触潜伏期比EPSCs更长这一事实表明，mSTN-LGP诱发的兴奋性反应可能是单突触介导的，而抑制性反应可能是多突触介导的。

在行为测试前1小时单侧给予LGP选择性CRHR1拮抗剂CP154526，单侧光遗传激活同半球的mSTN-CRH神经元。在mSTN-CRH神经元光遗传刺激的促进下，CP154526减弱了NREM睡眠和TMT暴露后的REM睡眠唤醒。它也损害了对Looming刺激的逃避反应。有趣的是，与对照组相比，光遗传激活mSTN-CRH神经元后的REM睡眠时间不受CP154526的影响。这些结果表明，mSTN-CRH LGP预测中的CRH/CRHR1系统可以控制觉醒和防御反应，但不能维持REM睡眠状态。

文章结论与讨论，启发与展望

现代生活中，与压力恐惧失调相关精神疾病如抑郁症和创伤后应激综合症中常见REM睡眠的改变，此外在帕金森病患者中，本研究中所关注的丘脑底核是深部脑刺激的常用治疗靶点之一，这个靶点的刺激往往导致患者睡眠结构改变。此项研究不仅为REM睡眠的防御功能提供实验基础，还解析了其中一条调控REM睡眠与本能恐惧的“共享”环路。此研究不只以一种全新的方式来理解大脑在维持生命体适应环境的重要角色，也为睡眠障碍及本能恐惧失调相关精神疾病共患病的诊断与治疗提供了可能的靶点[1]。

“Inscopix显微成像帮助我们回答了一个重要的问题。我们的研究聚焦在一群Crh神经元，虽然前期使用光纤记录发现这群神经元在快速眼动睡眠和天敌刺激下均有响应，但在这群神经元中，是单个神经元同时在快速眼动睡眠和恐惧刺激下兴奋，还是说这群神经元有不同的亚群分别对其响应？这用光纤记录等传统手段是难以分辨的。”本文作者介绍道，“使用Inscopix显微成像，我们可以追踪单个神经元在不同状态下的活性变化，从而在研究中证明较高比例快速眼动睡眠中有高活动的神经元同时也响应天敌刺激，为睡眠与恐惧调控的‘共享’神经环路这一结论提供实验支持。”

总而言之，适应性快速眼动睡眠反应可以保护我们免受威胁，并在其基础上揭示神经环路的一个关键组成部分。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.neuron.2021.12.033

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1. Neuron｜深圳先进院王立平团队揭示快速眼动睡眠参与本能恐惧反应的神经机

制版︱王思珍

本文完